Bioinformatik

Klonieren eines Genes mit ApE

Übungsdateien

Danke an Luise Brand für Anleitung und Übungsdateien

Abb.: http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/

ApE (A plasmid Editor) benutzt ein modifiziertes GeneBank Format zum speichern der Dateien.
Das hat die Dateiendung .ape

Wird der Austausch mit anderen Programmen gewünscht,
so sollte in den originalen Format mit der Dateiendung .gb gespeichert werden.
Außerdem gibt es in den Optionen die Einstellung, "striktes" GenBank-Format zu verwenden.

1. Gensequenz in einer Datenbank suchen.

Wir möchten uns mit einem Pflanzengen beschäftigen, das AtWRKY22 .

Dazu in der Arabidosis Gen Datenbank http://arabidopsis.org eine Suche starten.

Tair Gene Search

Abb.: Tair Gene Search

• "full length CDS " auswählen und die Sequenz kopieren.

ApE öffnen und im Menü Files : New... wählen.

Die Sequenz einfügen.

Die Datei als gb-Datei speichern.

Name ist WRKY22stop-CDS.gb

(Zur Kontrolle hier ist die Datei)

Abb.: Sequenz eingefügt

2. Gen in einen Vector pENTR-D-TOPO einfügen.

• Sequenzen markieren
  Menü Features : New Features
  
  
• Name eingeben
  Feature Type auf misc-feature klicken
  Farben für forward und reverse einstellen

Gateway Klonierung

Das Gen soll mit Hilfe einer Gateway-Klonierung in den Vector eingebaut werden.

• Sequenz des Gens WRKY22 kopieren
  
  
• Rekombinationsstelle cacc suchen und die kopierte Sequenz danach einfügen.
  
  
• Annotation mit dem Tool Feature
  Name ist WRKY22, Feature Type ist Gene - CDS
  
  
• Speichern als "pENTR_D-TOPO-WRKY22stop.gb"

Forward- und Reverse-Primer bestimmen
Der nächste Schritt ist sehr heikel und dazu ist Laborerfahrung notwendig.

• Forward-Primer beginnt mit der Rekombinationsstelle cacc und etwa 20 Basenpaare.
  Suchen verwenden Strg + F
  Dabei sollte eine Schmelztemperatur von etwa 60°C und 40 bis 50 % GC-Gehalt erreicht werden.
  Die entsprechende Sequenz markieren und die Werte können oben in der Leiste in ApE abgelesen werden.
  
  Den Forward-Primer annotieren
  Menü Features : New Features
  Name: PCR WRKY22 fwd primer
  Feature Type: binding - primer_bind
  Farben sind rot für forward und blau für reverse
  
  
• Reverse-Primer ist am Ende der Gensequenz von WRKY22, Endcodon ist tga.
  Wieder etwa 22 Basenpaare.
  Diese Sequenzen sind reverse complement
  
  Annotation
  Name: PCR WRKY22 compl rev primer
  rev-com aktivieren!
  Feature Type: binding - primer_bind
  Farben sind rot für forward und blau für reverse
  
  
• Die Datei speichern (zur Kontrolle siehe pENTR_D-TOPO-WRKY22stop.gb.
  
  

Der fertige Vektor kann als Bild dargestellt werden. Der Vektor ist zirkulär.

• Menü Edit : Circular <->linear
  
  
• Menü Enzyme : Grafic Map

Das Bild kann separat gespeichert werden. Dazu am einfachsten mit der rechten Maus auf das Bild und Copy Metafile wählen.
Anschließend das Bild zum Beispiel in PowerPoint einfügen.
Das Bild ist eine Vektorgrafik und kann deshalb gut in Vektorgrafikprogramme eingefügt werden (z.B. Adobe Illustrator)

Abb.: Eingefügtes Gen mit Forward und Reverse-Primer

Hinweis zu Suchen bei ApE.
Menü Edit : Find... (Strg + F)
Wenn der Suchstring auch in Reverse Complement gefunden werden soll
also find rev-com in string aktivieren.

Achtung
ApE kann nicht über das Ende der linearen Sequenz hinaussuchen auch wenn zirkulär eingestellt ist,
d.h. ggf. müssen Teile der Sequenz vom Ende an den Anfang verschoben werden.
wrap such in allen Bereichen.

Nützlich ist das Highlight des gesuchten.
Mit Menü : Clear Find Highlightning wird man das wieder los.

Die Primer werden nun bei einer Firma bestellt und sind für die PCR vorgesehen.

Dazu wird die Sequenz in ein Online Bestellformular eingetragen und nach gewisser Zeit
erhält man die Primer für die Laborphase in einem Eppi (Eppendorf Cup).

3. Im Labor: PCR und Amplifikation des Vektors in einem Bakterium

Nach erfolgreicher RNA Extraktion aus pflanzlichem Gewebe (in welchem WRKY22 exprimiert wird)
kann diese in cDNA mittels reverser Transkriptase umgeschrieben werden.

Anschließend wird mit der cDNA und den Primern eine PCR durchgeführt.

Das PCR-Produkt, d.h. das Gen kann nun mittels einer Topoisomerase in den Vektor pENTR-D-Topo eingebaut werden.

Der Vektor, ein Plasmid, wird in ein Bakterium (E. coli) eingeschleust und auf LB Platten mit Antibiotikum kultiviert.
Anschließend wird eine Kolonie in Flüssigmedium angezogen.

4. Restrinktionsverdau

Der Restrinktionsverdau dient als Kontrolle, ob tatsächlich das richtige Gen mit der PCR erstellt und richtig in den Vektor inseriert wurde.

Dazu muss man klug die richtigen Enzyme wählen. Dazu kann wieder ApE eingesetzt werden.

In unserem Beispiel sollten Enzyme, die etwa alle 3.500 bp schneiden ausgewählt werden.

Das Enzym sollte also ca. 2mal schneiden und die Stücke sollten unterschiedlich groß werden,
damit sie sich in der Elektrophorese im Gel unterscheiden.

Abb.: Enzyme Selection

• Die Datei pENTR_D-TOPO-WRKY22stop.gb öffnen.
  
  
• Menü Enzymes : Enzyme Selector...
  Select Enzymes equal to = 2
  Select
  Highlight
  Die Schnittstellen werden angezeigt
  
  Ein wichtiges Kriterium ist auch die Verfügbarkeit des Enzymes im Labor.
  Daher wird für unser Beispiel HindIII (schneidet im Gen) und PvuI (schneidet im Vector) gewählt
  
  
• Menü Enzyme : Digestion
  Das Fenster zeigt einen Verdau mit diesen beiden Enzymen HindII und PvuI.

Abb.: Enzymatischer Verdau

Wenn der tatsächliche Verdau genauso ausgesehen hat, ist das ein guter Hinweis, dass das Gen tatsächlich so vorliegt.

Aber nur eine Sequenzierung des Gens kann das genau beweisen.

5. Gen zur Sequenzierung schicken

Zum Glück ist die Sequenzierung heutzutage nicht mehr so teuer.

Das isolierte Gen im Vektor wird eingeschickt und man erhält, meist online (geht schneller) die entsprechenden Dateien.

6. Alignment: sequenziertes Gen mit dem WRKY22

Es werden 2 Dateien erhalten. Eine Datei, die Sequenzierdatei .seq enthält nur die Sequenz.
Dagegen wird mit der abi-Datei auch Informationen über die Güte der Sequenzierung erhalten.

• Öffne die abi-Datei 1988-M13-FP.ab1 mit ApE
  
  Es geht ein Fenster auf, dass für jede Base das Chromatogramm der Floureszenz enthält.
  Wie man sieht ist das Ergebnis, vor allem am Anfang und am Ende nicht so eindeutig.
  
  
  Abb.: Gensequenzierung - Chromatogramm
  
  
  
• Öffne die Sequenzdatei 1988-M13-FP.seq
  Hier werden die Basen mit "n" gekennzeichnet, die nicht bestimmt werden konnten.
  
  
  Abb.: Sequenziertes Gen - Beachte "n"

Wir wollen nun diese Sequenzdatei mit der ursprünglichen WRKY22 Sequenzdatei vergleichen.
Dazu wird ein Alignment durchgeführt.

ApE ist nur für solche einfachen Alignments geeignet.
Es gibt bessere Methoden und Programme für Alignment (CLUSTAL W)

• Geöffnete Datei 1988-M13-FP.seq
  
  
• Die WRKY22 Datei WRKY22stop CDS.gb öffnen
  
  
• Menü Tools : Alignment two Sequences
  Beide Dateien für das Alignment einstellen.
  
  



Abb.: Alignment

Es werden einige Stellen angegeben, wo das Alignment nicht stimmt.

Mit Hilfe der Abi-Datei kann entschieden werden wo die Sequenzierung fehlerhaft war.

Abb.: Alignment 2er Seuenzen - Missmatch wird angegeben.

Hinweis:
Mit einem Mausklick wird auf die entsprechende Stelle in den Ausgangsdateien gesprungen.

7. Translation der Sequenz

Eine weitere gute Kontrolle ist die Translation der erhaltenen Gensequenz.

• Öffne 1988-M13-FP.seq
  
  
• Suche Start ATG und Stopp-Codon TGA
  Siehe WRKY22stop CDS.gb für Start und Stop.
  Markiere die Sequenzen von Start bis Stop.
  
  
• Menü ORFs : Translate...
  Gewünschte Einstellungen vornehmen. Translate Selection
  

In der gezeigten Aminosäuresequenz sollten keine Stopps enthalten sein.

Hinweis
Mit einem Klick auf das *-Zeichen wird auf die Stelle in der Ausgangsdatei gesprungen.

Abb.: Translation

8. Gen in Pflanzenvektor

Abschließend soll das Gen in eine Pflanze eingeschleust werden. Dazu wird ein Pflanzenvektor eingesetzt.

In Frage kommt der Vektor pMDC7-ccDB.

pMDC7-ccDB.gb

In den Vektor wird mit Hilfe von Gateway-Klonierung das Gen eingebaut.

pMDC7-WRKY22stop.gb

Im Labor wird die Pflanze transformiert. Das Gen wird mit geigneten Promotoren exprimiert.

Das Aussehen und Zusammensetzung der Pflanzen wird wissenschaftlich ausgewertet.