Rastergrafik

ImageJ - Fiji

1. ImageJ und Fiji - Merkmale
2. Einfache Bildanalysen
   1. Berechnung einer Fläche
   2. Berechnung einer Linie
   3. Partikel zählen
3. Image Analyse
   1. Beispiel 1 - Farbintensität messen - GUS Staining
   2. Beispiel 2 - Compositbild - Lysosomen
4. Plugins und Makros
   1. Makro aufzeichnen
   2. Beispiel integriertes Plugin -Ein 1D Gel auswerten
   3. Beispiel integriertes Plugin 3D

1. ImageJ und Fiji - Merkmale

Webseite Fiji

Dokumentation

User Guide

Entwicklernetzwerk

Beispielbilder

ImageJ ist nicht nur ein Bildbearbeitungsprogramm.
ImageJ wird in der Biologie vor allem in der Bildverarbeitung eingesetzt.
In der Bildverarbeitung geht es um die Analyse eines Bildes und informationtechnischen Verarbeitung von Bildsignalen.
Es werden Bilddaten vermessen und analysiert.

ImageJ ist in Java geschrieben und daher plattformunabhängig. Es ist auf Linux, Windows und Mac lauffähig.
Das Programm liegt nur in einer englische Version vor.

Es ist Open Source und daher kostenlos (Info).
Angefangen wurde das Programm von Wayne Rasband einem Mitarbeiter am National Institutes of Health, USA.
Inzwischen arbeiten weltweit Freiwillige an dem Programm und entwickeln es weiter (Neueste Entwicklungen).

Das Programm ist durch Plugins erweiterbar und daher sind viele Anwendungen erst möglich
Es wird als "Schweizer Messer" der Bildanalyse bezeichnet (Wikipedia)

Vorläuferversion für Macs war NIH Image, das für Mac OS 9 noch erhältlich ist.

Stabile Version ist 1.53j - Feb. 2022 (Download).
Auf der Downloadseite wird nicht unbedingt die letzte Version angeboten.
Das Programm kann leicht über das Menü Help und Update ImageJ aktualisiert werden.

Ich empfehle unter Windows die Programme ImageJ und Fiji (s.u.) nicht in den Windows Programmordner zu installieren.
Den Ordner auf einen zugänglichen Ort auf den Computer aus der ZIP-Datei kopieren.
Zum Beispiel c:\Fiji.
So sind die Plugins- und Macro-Ordner ohne Adminrechte zugänglich und Updates leichter möglich (Installation).

Während ImageJ maßgeblich von Wayne Rasband, dem Begründer von ImageJ weiter entwickelt wird und nur Kernkomponenten enthält, wird die Version ImageJ2 (Link) von einem Team betreut (Wikipedia).
Für Biologen empfehle ich Fiji (siehe unten) zu installieren (ImageJ2 Download).

Von ImageJ sind eine Reihe von Abwandlungen entwickelt worden, die an bestimmte Anwendungen angepasst wurden.
Siehe unter Software based on ImageJ
Zum Beispiel Fiji für Projekte in der Mikroskopie.

In BIO7 (Link) und BoneJ (Link) ist ImageJ zur Darstellung und Analyse der Bilder in das Programm integriert.

Seit 2012 gibt es für den Austausch in der "Bioimage Information" die ICY Internet Plattform
icy.bioimageanalysis.org/
Das angebotene Programm ICY basiert auf ImageJ.

Für ImageJ wurden eine ausführliche Dokumentation und ein User Guide erstellt.
(Siehe auch imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide.pdf

Fiji Cookbook
imagej.net/Cookbook


Es gibt eine gut erläuterte Einführung in Image Analyse mit ImageJ und Fiji von Peter Bankhead, 2014:
petebankhead.gitbooks.io/imagej-intro/content/

Fiji
fiji.sc
imagej.net/Welcome

"Fiji Is Just ImageJ"
Ein OpenSource Projekt, das in den Neurowissenschaften entstanden ist.
Es fügt ImageJ eine ganze Sammlung von Plugins hinzu und tritt auch als eigenes Programm auf.
Integriertes Update System.
Attraktiv für Entwickler, Plugins können leicht hinzugefügt werden
Infos Wikipedia

Ich empfehle Fiji statt ImageJ zu installieren.

Auch für die Mikroskopie gibt es eine umfangreiche Sammlung an Plugins, MBF-Plugin-Collection
rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mbf/index.html
Neuerdings wird es, in Fiji eingepflegt.
fiji.sc/MBF_Plugin_Collection

Installation
ImageJ ist ein Java Programm. Die angebotenen Windows Downloaddateien enthalten bereits Java ("bundled with 64-bit Java 1.xxx").
Java muss also nicht extra installiert werden. Ist Java auf dem Rechner, kann auch eine ImageJ Version ohne Java installiert werden.

Es wird empfohlen ImageJ nicht in dem Windows Ordner "Programme" zu installieren. Dann sind die Makro- und Plugin-Ordner ohne Adminrechte verfügbar und können leicht erweitert werden.
Es werden dann auch keine Adminrechte für die Installation benötigt.

Auch Fiji möglichst nicht in den Windows Programmordner installieren (Download und Installation Fiji)

Merkmale (siehe Wikipedia)

• Bearbeitet, analysiert und druckt 8-Bit, 16-Bit und 32-Bit Bilder (pro Farbkanal) sowie 8 Bit Farbe und RGB-Bilder.
  
  
• Öffnet die Formate TIFF, PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS sowie RAW Formate
  durch Plugins besteht die Möglichkeit weiterer proprietärer Formate (Leica, Zeiss,...) zu öffnen.
  
  
• Kann mit Bildstapel umgehen ("Stacks").
  
  
• Unterstützt Multithread Prozessoren und Mehrkern CPU und kann daher gut rechenintensive Operationen durchführen.
  
  
• Kann die Pixel in einer Fläche berechnen und auf Grund dieser Berechnungen Histogramme zeichnen
  (siehe Banden in einem Gel).
  
  
• Entfernungen, Flächen und Winkel berechnen (siehe Wurzellängen, Flächen und Winkel bei Blattstellungen)
  
  
• Kann mehrere Bilder gleichzeitig öffnen und bearbeiten.
  Die mögliche Bearbeitung wird nur durch den zur Verfügung stehenden Arbeitsspeicher begrenzt.
  (siehe Bildanalyse)
  
  
• Kontrast Änderungen, Convolution, Fourier Analyse.
  
  
• Geometrische Transformations wie Vergrößerungen, Spiegelungen und Drehungen.
  
  
• Durch Java-Plugins und Makros kann die Fähigkeit des Programms ausgebaut werden.

2. Einfache Bildanalysen

Im folgenden wurde Fiji verwendet. Auch wenn von ImageJ die Rede ist. Merke Fiji is just ImageJ.

ImageJ und Fiji sind in frei schwebenden Fenstern organisiert.

Beim Öffnen des Programms wird die Toolbox Palette geöffnet.

Abb.: Toolbox ImageJ - aus der Fiji Installation

Einige Werkzeuge sind mit einem kleinen roten Pfeil nach unten "v" gekennzeichnet.
Rechtsklick mit der Maus öffnet darunter weitere Werkzeuge.

Doppelklick öffnet ein Eigenschaftsfenster für das jeweilige Werkzeug.


Abb.: Toolbox - Rechtsklick mit der Maus auf ein Werkzeug (Fiji).


Auf die 2 roten Pfeile nach rechts klicken >> es öffnen sich weitere Tools und Plugins.

Abb.: Toolbox - weitere Plugins für die Symbolleiste (Fiji)



Search Bar und Command Finder

Die Menüstruktur ist nicht sehr übersichtlich. Zum Glück gibt es die Search Bar oder den genialen Command Finder.

Unten rechts befindet sich ein Suchfester (Search Bar). Wird ein gesuchter Begriff eingegeben, öffnet sich automatisch das Fenster Quick Search.

Abb.: Search Bar - in der neuen Version ist das Fenster im Hauptfenster integriert. - "color" wird gesucht
Suchergebnisse werden in einem Fenster "Qucick Search" geöffnet.

Neben der Search bar kann auch der ältere Command Finder verwendet werden.
Ein Befehl lässt sich leicht über den Command Finder suchen und ausführen.
Menü Plugins : Utilities : Find Commands

• Das Tastenkürzel zum öffnen ist L oder Strg + L
  In dem Suchfenster den gewünschten Befehl eintippen. Es genügt ein Teil des Wortes einzugeben.
  Der Command Finder zeigt den Befehl im Menü an (Show full information aktivieren).
  Über das Fenster kann der Befehl mit einem Klick sofort ausgeführt werden
  
  
  
  
  

Datei öffnen

Öffnet die Formate TIFF, PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS sowie RAW Formate
durch Plugins besteht die Möglichkeit weiterer proprietärer Formate (Leica, Zeiss,...) zu öffnen.

Beispielbild (Quelle ImageJ)
File : Open Samples : Empryos

• Menü File : Open...
  
  
  
  Abb.: Beispiel embryos.jpg - das Bild befindet sich unter File : Open Samples : Embryos
  
  Das Bild wird in einem eigenen Fenster geöffnet.
  
  

Neues Bild

Neue Bilder werden mit Menü File : New : Image... erstellt.

Sehr nützlich ist das Öffnen eines Bildes aus der Zwischenablage.
Dadurch kann leicht ein Bild aus einer anderen Anwendungen geöffnet werden.

• Menü File : New : System Clipboard
  
  
  Abb.: Bild aus der Zwischenablage
  
  
  
  

Berechnung einer Fläche

Mit ImageJ lassen sich einfach Abstand, Fläche oder Winkel in einem Bild berechnen.

Wir wollen mit der Fläche anfangen.

• Mit den Tools Rectangular (Rechteck), Oval (Ellipse), Polygon oder Freehand Selection (Freihand) eine Fläche markieren
  Selection Brush Tool erforder eine vorherige Auswahl. Die Auswahl kann mit dem Tool geändert werden.
  Wand (Tracing) kann mit der Tolerance eingestellt werden (Siehe Tipp unten).
  
  
  
  
  
• Menü Analyse : Measure (Strg + M)
  Ein weiteres Fenster öffnet sich und zeigt die Ergebnisse an.
  
  
  Abb.: Fläche berechnen
  
  Die Fläche wird in Pixel * Pixel gemessen.
  Wie kann in µm² oder mm² umgerechnet werden?
  (Lösung: Berechnung einer Linie s. u., Maßstab in dem Bild und Dreisatz benutzen)
  
  Die Einstellungen für die Messungen befindet sich unter
  
  Menü Analyze : Set Measurements...
  
  
  Abb.: Berechnen einstellen (Fiji)
  
  
  Tipp - Fläche markieren mit dem Zauberstab (Wand Tool):
  Bei dieser Aufgabe hilft das Werkzeug (Wand) Tracing.
  Doppelklick auf das Symbol, das aussieht wie ein Zauberstab, in der Toolbox öffnet das Fenster zum Einstellen des Werkzeuges.
  Dort den geeigneten Schwellenwert Tolerance einstellen.
  Das ist für die Einzellstadien leicht zu bewerkstelligen.
  Nun kann mit einem Mausklick die Fläche markiert werden.
  
  
  Abb.: Zauberstab - Wand (Tool) - Doppelklick...
  
  
  
  Abb.: Zauberstab - Wand (Tool) - Eigenschaften öffnen sich. Die Toleranz kann eingestellt werden.
  

Aufgabe: Öffne das Beispiel Embryo und berechne die Fläche der Zellen.

Berechnung einer Linie

• Mit Tool Straight line selection eine Linie markieren
  Segmentet Line - Polygonlinie
  Freehand Line - Freihandlinie
  Arrow tool - Pfeillinie (Doppelklick öffnet die Eigenschaften)
  
  
  
  
  
  
  
• Menü Analyse : Measure (Strg + M)
  
  
  

Aufgabe: Öffne das Beispiel Embryo und berechne den Durchmesser der Zellen.
Beachte den Maßstab. Wie kann der Durchmesser in µm gemessen werden?

Winkelmessung

• Mit Tool Angle einen Winkel markieren
  
  
  
  
  
• Menü Analyse : Measure (Strg + M)
  
  
  
  
  
  

Partikel zählen

Partikel zählen ist in der Biologie ein beliebter Zeitvertreib. Daher wird das etwas ausführlicher behandelt.
Im Laboralltag werden dazu Zählgeräte verwendet.

Mit ImageJ kann zuverlässiger gezählt werden. Auch ein automatisches Zählen ist möglich. Dafür gibt es Plugins.

• Mit Point Tool aus der Toolbox
  
  
  Umschalt + Klick mit der Maus die Partikel markieren
  Oder das Multi-Point Tool verwenden.
  Die gezählten Partikel werden markiert und nummeriert
  
  
• Menü Analyse : Measure (Strg + M)
  Gibt die Zahl und die genaue xy-Position der Partikel aus.
  
  
  
  Abb.: Partikel zählen
  
  Hinweise
  Mit einem Doppelklick auf das Tool kann das Tool eingestellt werden.
  
  Das Tool Multi-point Tool kann dasselbe, die Taste Umschalt wird gespart.
  Mit Strg kann ein Zählpunkt gelöscht werden.
  
  Mit der Taste Alt + Y wird die Gesamtanzahl ausgegeben.
  
  
  
  
  
• Cell Counter:
  Extrem nützlich bei verschiedene Typen von Partikeln ist der Cell Counter.
  Menü Plugins : Analyze : Cell Counter
  Hilft beim Zählen von Partikeln.
  Es können 8 verschiedene Typen gezählt werden!
  
  Abb.: Cell Counter
  
  
  
  
  
  
• Analyze Particles
  Es soll automatisch die Fläche der Partikel in einem Bild gemessen werden.
  Die Methode ist nicht perfekt!
  
  
  
• • Menü Analyze : Analyze Particles
    
    
    
    Abb.: Analyze Particles
    
    
    Bild muss vorher in ein Schwarzweißbild umgewandelt werden.
    Zählt automatisch die Partikel ab einer einstellbaren Größe
    
    Im Beispielbild embryos.jpg
    Size: 100-Infinity
    Das hängt von der Anwendung ab.
    
    Hier eine kleine Anleitung:
    Bild öffnen
    1. Bild in SW Bild umwandeln
    Menü Process : Binary : Make Binary...
    
    Alternativ geht das Bild in ein Graustufenbild umwandeln mit Menü Image : Type 8-bit
    und Schwellenwert einstellen mit Menü Image : Adjust : Threshold
    (Einstellung zum Beispiel 0 - 131)
    
    2. Öffne Menü Analyse : Analyze Particles
    Ein kleines Fenster öffnet sich. Mit Size und Circularity können Artefkte ausgeschlossen werden.
    
    
    3. Schaltfläche OK öffnet den ROI Manager (ROI=Regions of Interest)
    Menü Analyze : Tools : ROI Manager
    
    Im Fenster Result wird das Ergebnis angezeigt.
    
    Abb.: Analyze Particles - beachte Fehlzählungen, z.B. bei "10", es wurden 2 Partikel gemessen und bei "25" und "26".
    
    
    
    
    
• Plugin Colony Counter von Bruno Vieira
  rsbweb.nih.gov/ij/plugins/colony-counter.html
  Zum Zählen von Bakterienkolonien auf Petrischalen
  
  Beispiel
  1. Das Plugin (siehe unten) ist in der Standardinstallation noch nicht enthalten.
  Das Plugin in den Ordner Plugin unter dem Programmordner von ImageJ kopieren
  2. ImageJ öffnen und das Plugin Colony Counter öffnen.
  Die Kolonien sollten als heller Bereich auf dunklem Hintergrund erscheinen.
  Eventuell mit Menü Edit : Invert das Bild ändern
  Wenn der Hintergrund stark uneinheitlich wirkt mit Menü Process : Subtract Background... den Hintergrund bearbeiten.
  3. Open Image im Fenster Colony Counter
  4. Colony Size (pixel^2) und Circularity einstellen.
  Nach Veränderung die Enter Taste drücken und das Bild wird neu ausgewertet.
  5. Die gefundenen Kolonien werden in dem Fenster ROI Manager angezeigt (ROI = Region of Interest) und gezählt.
  Show All aktivieren, die Colonien werden in der Abbildung mit einem Overlay bezeichnet.
  Zusätzliche Kolonien können mit Add(t) hinzugefügt werden.
  Measure generiert eine Tabelle.
  
  
  
• Tutorials YouTube
  
  siehe auch Kevin Foley YouTube Tutorial
  
  Automated Cell Counting in ImageJ
  see ICTN Plugin
  
  
  Neues Plugin 2020 - ausführliche Beschreibung - ImageJ/FIJI plugin: Semi-automatic cell-by-cell object-based colocalization analysis
  

3. Image Analyse

Es sollen einige Techniken der Bildanalyse vorgestellt werden.
Ausführliche Anleitungen finden sich unter
Peter Bankhead, 2014:
http://blogs.qub.ac.uk/ccbg/fluorescence-image-analysis-intro/
Eine Beschreibung des Beispiels Zahl und die Größe der Lysosomen findet sich dort ab Seite 51.

Für Hilfe siehe auch das ImageJ Cookbook
http://imagej.net/Color_Image_Processing

Beispiel 1 - Farbintensität messen - GUS Staining

Abb.: Arabidopsis Blatt - GUS Staining (Quelle: Ursula Fürst, ZMBP)

Gus-staining-image-1

Gus-staining-image-2

Python program

Die Pflanze wurde mit Hilfe der "GUS Staining" Technik behandelt. Die Unterschiede zeigen sich in der Intensität der Blaufärbung.
Ziel ist es die Fläche und die Intensität der blauen Bereiche zu messen.

1. Bild ausschneiden (Crop) und Duplikat erstellen
Crop: Überflüssiger Hintergrund beseitigen. Rechteck um das Bild und dann ausschneiden (falls erforderlich)
Es ist ratsam mit einem Duplikat zu arbeiten. Der Wiederherstellungsschritt (Edit : Undo...) bei Fehlern kann nicht immer durchgeführt werden.

Tool Rectangular
Mit dem Auswahlwerkzeug ein Rechteck um das Blatt aufziehen. Überflüssiger Hintergrund wird beseitigt
Image : Crop...

Duplicat erstellen
Image : Duplicate...
oder Strg + Umschalten + D

2. Gesamte Blattfläche messen
Wenn der Anteil des betroffenen Bereichs interessiert, muss auch die gesamte Blattfläche gemessen werden.
Es gibt ja große und kleine Blätter.
Da das Blatt einen weißen Hintergrund hat ist es einfach den Hintergrund auszuwählen und die Auswahl dann umzukehren.

Wand (tracing) tool
mit der Maus auf den Hintergrund, der Hintergrund ist ausgewählt. Die Auswahl wird mit einer farbigen Linie gezeigt.
(Farbe der Auswahllinie kann mit Doppelklick auf das Pointer Tool eingestellt werden)
Korrekturen, können gut mit dem Selection Brush Tool (unter Oval) hinzugefügt oder abgezogen werden.
Doppelklick stellt die Größe Size ein. Mit Taste Shift hinzufügen und mit Alt abziehen.
Es soll aber das Blatt ausgewählt werden, daher muß die Auswahl umgekehrt werden.
Edit : Selection : Make Inverse
Kehrt die Auswahl um, das Blatt ist nun ausgewählt
(Alternativ mit dem Wand tool gleich auf das Blatt klicken und dann Doppelklick auf das Wand Tool in den Eigenschaften des Tools die Toleranz hochstellen bis das Blatt markiert ist.)

Analyze : Measure
oder Strg + M
Die Fläche des Blattes wird in die Resulttabelle (eigenes Fenster) geschrieben.

3. Blau gefärbter Blattbereich soll markiert werden mit Color Threshold
Die Fläche des blau gefärbten Blattes soll ermittelt werden (Area siehe unten).

Image : Adjust : Color Threshold...
Color Space: HSB
Hue ca. 80 -255 Pass
Saturation ca. 15 - 255 Pass
Brightness ca. 0 - 240 Pass

Die gewählten Bereiche erscheinen rot, bitte kontrollieren.

Select

Color Threshold schliessen.

Hintergrund (nicht gefärbter Blattbereich) ausschneiden
Edit : Clear Outside

4. Gewählter Bereich in HSB umwandeln und Saturation Bild analysieren.
Die Intensität der Blaufärbung soll ermittelt werden (Integrated Density)
Je mehr Farbe, desto höher ist die Sättigung. Mit dem HSB Farbmodel kann das berechnet werden.

Image : Type : HSB Stack
Mit der horizontale Verschiebeleiste unter dem Bild auf Saturation stellen

Bereich analysieren
Analyze : Set Measurement
Integrated Density und Area aktivieren

Analyze : Measure
oder Strg + M

In der Resulttabelle stehen zwei Zeilen. Die Gesamtfläche und die Messung des blau gefärbeten Blattes.
Je höher die Blaufärbung, um so höher die Integrated Density

Der ganze Ablauf als Macro.

Abb.: Arabidopsis Blatt - GUS Staining - blau gefärbter Bereich wurde die Sättigung gemessen

Beispiel 2 - Compositbild - Lysosomen

Es wird das ImageJ Beispielbild hela-cells.tif verwendet. Es ist ein Compositbild aus der Fluoreszenzmikroskopie.
Es besteht aus 3 Kanälen (Lysosomen - rot, Mitochondrien - grün und Zellkern -blau).

Ziel ist es die Zahl und die Größe der Lysosomen zu bestimmen.

Datei öffnen

Es wird die Beispieldatei aus den ImageJ Ordner geöffnet.

• Menü File : Open Samples : HeLa Cells (1.3M, 48-bit RGB)

Abb.: Beispieldatei öffnen

Das Bild ist ein 16 bit je Kanal "Composite image". Es gibt 3 Kanäle, die mit einem Schieberegler unterhalb des Bildes gezeigt werden.
Weitere Informationen zum Bild werden mit dem Tastenkürzel I in einem eigenem Fenster gezeigt.

Abb.: Beispieldatei hela-cells.tif - Composite Image

Die einzelnen Kanäle werden mit einem Schieberegler unterhalb des Bildes angesprochen.
Zum Beispiel kann für jeden Kanal die Helligkeit und der Kontrast eingestellt werden.
Kanal wählen und mit Menü Image : Adjust : Brightness & Contrast im Fenster B&C die Einstellung vornehmen.

Unter Menü Image : Lookup Tables kann die Farbe für jeden Kanal eingestellt werden.

Einzelne Kanäle anzeigen und analysieren

Die einzelnen Kanäle können mit dem Channels Tool untersucht werden

• Menü Image : Color : Channels Tool

Abb.: Beispieldatei hela-cells.tif - Composite Image

Mit dem Werkzeug Channels Tools können einzelne Kanäle sichtbar/unsichtbar gemacht werden.
More... öffnet weitere Werkzeuge. Hier kann in eine RGB Abbildung umgewandelt werden oder die Kanäle können in einzelne Abbildungen aufgespalten werden.

Schließlich kann hier auch jeder Kanal mit einer anderen Farbe belegt werden, dazu wird die LUT mit Edit LUT...bearbeitet oder geändert.

Da uns nur hier das Bild mit den Lysosomen interessiert ("roter" Kanal), werden wir diesen Kanal als einzelnes Bild kopieren.

Das kann mit Split Channels im Channels Tools erfolgen.
Alternativ befindet sich der Befehl für Split Channels auch im Menü Image : Colors : Split Channels
Kanal wählen, mit Strg + C kopieren und mit Menü File:New... Internal Clipboard als neues Bild einfügen.

Einfacher geht das mit Menü Image : Duplicate oder Tastenkürzel Strg + Umschalten + D
Es öffnet sich ein Fenster in dem der duplizierte Kanal gewählt werden kann.

Abb.: Duplizieren eines Kanals als Bild - hier Channels(c) 1 einstellen

Wir wählen den Kanal 1, den Kanal für die Lysosomen, LUT rot.

Hinweis: Duplizieren ist bei ImageJ immer ratsam. Das "Undo" Tool kann bei vielen Werkzeugen einen Fehler nicht rückgängig machen.
Gut ist es daher wenn der vorherige Zustand noch als Bild vorliegt


Abb.: Das duplizierte Bild - Kanal 1 Lysosomen

Threshold

Ziel ist es herauszufinden, wieviele Lysosomen vorzufinden sind und wie groß die Organellen sind.

Dazu könnte das Werkzeug Partikelzählen eingesetzt werden. Hier wird mit dem Werkzeug Threshold gearbeitet.

• Menü Image : Adjust : Threshold...

Abb.: Threshold - Method Otsu, vorher wurde Process : Subtrack Background mit Rolling Ball Radius = 10 Pixel durchgeführt.

Jetzt erfolgt der schwierigste Schritt. Wir haben einen dunklen Hintergrund, daher Dark background aktivieren.
Mit den Schiebereglern muss das Bild so erscheinen, dass nur die Lysosomen erscheinen und der diffuse Hintergrund verschwindet.
Das ist nicht sehr reproduzierbar.

Daher sind in ImageJ dafür einige Methoden eingebaut, die dafür entwickelt wurden.
Hier eine kurze Beschreibung der Methoden für Fiji
http://fiji.sc/Auto_Threshold#Available_methods
In unserem Beispiel waren Otsu und Triangle erfolgreich.

Das Vorgehen wird entscheidend verbessert, wenn vor diesem Schritt Menü Process : Subtract Background durchgeführt wird.
In unserem Beispiel passt die Einstellung Rolling Ball Radius = 10 Pixel.

Threshold erzeugt ein "Binary Image", das nun leicht auf Zahl und Größe untersucht werden kann.
Ein Binary Image besteht nur aus den Farben schwarz und weiß.

Hinweis von Stefan Bieker:
Manueles Thresholding (Einstellung per Schieberegler) nicht nur von links sondern auch von rechts.
Da gesättigte Pixel bei Berechnungen Probleme machen.

Create Selection

Das mit dem Werkzeug Threshold erzeugte Binary Image (s.o.) wird verwendet um mit Create Selection eine Auswahl zu erzeugen.

• Menü Edit : Selection : Create Selection
  
  

Abb.: Create Selection - die Auswahl ist gelb

ROI Manager

Das Fenster ROI Manager ist in ImageJ ein sehr wichtiges Werkzeug. Es kommt immer dann zum Einsatz,
wenn nur Teile eines Bildes untersucht werden sollen.
ROI bedeutet "Region of Interest".

• Menü Analyze : Tools : ROI Manager

Da es so häufig benutzt wird, wurde ein einfaches Tastenkürzel eingebaut.

In unserem Beispiel genügt es auf das Bild mit der Auswahl zu klicken und T einzugeben.
Der ROI Manager wird geöffnet und die Auswahl wird automatisch eingetragen.

Abb.: ROI Manager - die Auswahl wird mit "T" automatisch eingetragen.

Wir möchten aber nicht die gesamte Auswahl, sondern die einzelnen Bereiche (Lysosomen).
Unter More >> befinden sich noch weitere Werkzeuge.
Für uns nützlich ist Split.
Daher die Auswahl im ROI Manager markieren und More >> Split aufrufen.


Abb.: ROI Manager - Auswahl mit Split aufgespalten.

Die einzelnen Bereiche werden im ROI Manager eingetragen.

Die alte, gesamte Auswahl kann nun gelöscht werden (Im Beispiel mit der Bezeichnung 0240-0351).

Kontrolle - Auswahl auf ursprüngliches Bild anwenden

Zur Überprüfung der Auswahl wird das ursprüngliche Bild ausgewählt und mit Show All wird die
Auswahl als Overlay im ursprünglichen Bild gezeigt.
Die Regions of Interests ROI sind auf jedes Bild anwendbar.
Es kann daher in jedem Bild Messungen (nächster Schritt) durchgeführt werden.


Abb.: ROI Manager - Auswahl auf ursprüngliches Bild anwenden

In einem letzten Schritt möchten wir die Auswahl messen.

Zuvor die gewünschte Einstellung für die Messung durchführen.

• Menü Measurement : Set Measurement

Abb.: Set Measurement

Im ROI Manager kann mit dem Schalter Measure die Messung dann durchgeführt werden.

Das Result Fenster öffnet sich mit den Messdaten.

Abb.: Result

Die Ergebnisse können mit Kopieren und Einfügen zum Beispiel in Excel importiert werden.
Dort kann eine weitere Analyse erfolgen.


Diese lange Kette von Befehlen kann durch ein Makro automatisiert werden.
Das wird im nächsten Kapitel Plugins und Makros erläutert.

4. Plugins und Makros

Eine Liste der Plugins gibt es auf der ImageJ Seite
rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html

Einige Plugins sind nach der Installation von ImageJ bereits integriert.

• Eigene Plugins werden mit Menü Plugins : New : Plugins erstellt.
  

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit auch Makros zu schreiben oder aufzuzeichnen.
Diese Makros werten als Textdatei (.txt) abgespeichert.
Dafür bieten sich eine Serie von Befehlen an, die aufgezeichnet werden und als Mako abgespeichert werden.

Ein schönes Beispiel befinden sich unter
Peter Bankhead, 2014 ab Seite 117:
blogs.qub.ac.uk/ccbg/fluorescence-image-analysis-intro/

Makro aufzeichnen

• Menü Plugins : Macros : Record
  
  
• Gewünschte Befehle durchführen
  
  
• Create
  Das Makro wird als Textdatei abgespeichert.

Abb.: Makro Aufzeichnung

Als Beispiel wurde die Übung oben eine Messung der Lysosomen aus Hela Zellen durchgeführt.

In Fiji wird der Text farbig ausgezeichnet, das sieht sehr übersichtlich aus.
Daher ist Fiji bei der Erstellung von Makros zu empfehlen.

Abb.: Makro in Fiji- farbige Auszeichnung

Hier der Text zum kopieren:

run("Duplicate...", "title=copy-channel1.tif duplicate channels=1");
run("Subtract Background...", "rolling=5");
setAutoThreshold("Otsu dark");
//run("Threshold...");
setAutoThreshold("Otsu dark");
run("Convert to Mask");
run("Create Selection");
run("Add to Manager");
roiManager("Add");
roiManager("Select", 0);
roiManager("Split");
roiManager("Select", 0);
roiManager("Delete");
roiManager("Measure");

Makro starten

• Bild öffnen
  
  
• Menü Plugins : Macros : Run
  
  
• Makro auswählen

Beispiel integriertes Plugin
Ein 1D Gel auswerten

Für die Auswertung eines Elektrophorese-Gels gibt es kostspielige Software.
Mit ImageJ und einem integriertem Plugin kann ein Gel ausgewertet werden.
Dabei ist jeder Schritt nachvollziehbar. Dagegen ist bei vielen gekauften Programmen die Auswertung unklar.

Tipp:
Als Alternative gibt es das Programm GelAnalyzer http://www.gelanalyzer.com/ .
Es ist kein ImageJ Programm.
Für Bildungseinrichtungen kostenlos.
Java-Programm, daher für Windows, Mac und Linux verfügbar.

Beispielbild (Quelle ImageJ)

Abb.: 2D-Gelelektrophorese - Menü File : Open Samples : Gel

• Mit dem Tool Rectangular Selection die erste Spur ("Lane") markieren
  
  
• Menü Analyze : Gels : Select First Lane (Stg + 1)
  
  
  
  Abb.: 2D-Gelelektrophorese: die erste "Lane" auswählen.
  
  
• Die Auswahl auf die 2. "Lane" verschieben. Am besten die Richtungstasten auf der Tastatur verwenden
  
  
• Menü Analyze : Gels : Select Next Lane (Stg + 2)
  Am besten mit dem Tastenkürzel arbeiten.
  Auf diese Weise alle "Lanes" markieren
  
  
• Menü Analyze : Gels : Plot Lanes (Stg + 3)
  
  
  Abb.: 2D-Gelelektrophorese: Plots of Gels. Lane 1 oben im Vergleich und Lane 2 unten
  
  
  Hinweis:
  Wenn die Plots falsch orientiert sind, nach unten statt nach oben,
  in Menü Analyze : Gels : Analyze Options darin Invert Peaks einstellen.
  Daraufhin im Menü Analyze : Gels : Replot Lanes den Plot erneut durchführen
  
  
  
• Nun kommt ein entscheidender Punkt.
  Mit dem Tool Straight line selection eine Basislinie einzeichnen.
  Wie die Basislinie gezogen wird, erfordert einige Überlegungen.
  Mit dem Tool Segemeted line werden Linien für die Basislinie gezogen, die korrigiert werden können;
  anschließend mit Menü Edit : Fill (Strg + F) finalisieren.
  
  Hinweis!
  Die Flächen unter den Peaks müssen für den folgenden Schritt geschlossen sein.
  Mit dem Scrolling Tool (Leertaste) kann die Abbildung bewegt werden.
  Mit Magnifing Glas (+ oder -) kann die Abbildung vergrößert oder verkleinert werden..
  
  
  Abb.: 2D-Gelelektrophorese: Basislinie einzeichnen.
  
  
  
  Mit dem Tool Wand (tracing) die gewünschten Flächen unter den Peaks auswählen.
  
  
  Abb.: 2D-Gelelektrophorese: Flächen berechnen
  
  Es wird in dem Result-Fenster die Fläche ausgegeben.
  In Menü Analyze : Gels : Label Peaks können im Plot die Peaks bezeichnet werden
  
  In Menü Analyze : Set Measurments wird das Ergebnis eingestellt.
  
  
  Abb.: Set Measurments
  
  Die Ergebnisse im Result-Fenster können leicht mit Kopieren und Einfügen in Excel
  übertragen werden.
  
  Tipp:
  Die Zahlen liegen mit einem Punkt als Dezimalstelle vor.
  Daher in Excel einen "Textimport-Assistenten" verwenden, siehe unter den Einfüge-Optionen, Symbol rechts unten.
  
  
  Hintergrund reduzieren
  
  Manchmal ist die Auswertung einfacher, wenn vorher der Hintergrund reduziert wird. Das Ziehen der Basislinie fällt leichter.
  Das Bild mit dem Gel öffnen und vor der Analyse der Peaks
  mit Menü Process : Subtract Background...
  kann der Hintergrund beseitigt werden.
  Dadurch kann einfacher eine Basislinie gezogen werden.
  In dem Beispiel ist Rolling Ball Radius: 50 Pixels zu empfehlen und Light background,
  benutze Preview,
  mit Create Background kann der Hintergrund dargestellt werden.
  
  Achtung die bearbeiteten Bilder eignen sich nicht mehr für die Veröffentlichung!
  Siehe ImageFraud
  
  
  Abb.: Hintergrundrauschen beseitigen
  
  
  Versuche auch den Hintergrund mit folgenden zu beseitigen
  Menü Image : Adjust : Brightness/Contrast
  
  
  Abb.: Hintergrundrauschen beseitigen - dem Tool Brightness/Contrast
  
  Ein Versuch ist auch das folgende Werkzeug wert.
  Menü Image : Adjust : Threshold
  
  
  Hinweis
  Als Wissenschaftler sollte einem bewusst sein, dass mit der Beseitigung des Hintergrundes
  die Gefahr besteht, wichtige Peaks auch zu beseitigen.

Beispiel integriertes Plugin 3D

Beispiel (Quelle ImageJ)

• Öffne die Datei
  
  Menü Plugins : 3D : ImageJ3D
  
  
  Abb.: ImageJ 3D Viewer
  
  
• Menü Plugins : 3D : Volume Viewer
  (Siehe dafür auch in Menü File : Open Sample : Flybrain.tif)
  
  
  Abb.: Volume Viewer
  
  Mit dem Volume Viewer lassen sich Schnitte betrachten und auch die Farben getrennt darstellen.

Test auch die anderen 3D Tools.
Image 3D Viewer

3D Animation erstellen

• Menü Image : Stacks : 3D Project
  
  
  
  Mit Menü File : Save as... : AVI kann die Projektion als Film gespeichert werden
  
  

Teste auch die anderen Stack Tools. Was macht das Z Project?